cytoskeleton and cell movement <actin>

structural role 
cell movement (movement of entire cells, internal transport of organelles, other structures(e.g mitotic chromosome through the cytoplasm)
  
actin filament
microtubule
intermediate filament 위의 3개가 모두 같이 뭉쳐있으며 subcellular organelles, plasma membrane과 연결되어 있다.

ATP bound G-actin monomer

<actin filament>
근육에서 가장 먼저 발견되었다.
G-actin은 375 amino acids로 구성된 globular protein(43 kDa, asymmetric structure)
7nm의 지름, 모든 eukaryotes 의 total protein의 5~10%을 차지한다.
  
eukaryotes는 진화를 거치면서 모든 유사한 actin을 가지게 된다.
yeast actin은 mammalian cells과 90%의 동일성을 띤다. 
심지어, MreB protein은 prokaryotes에서도 cell division, cell shape을 결정하는 actin-related protein이다.
  
plasma membrane의 바로 밑에 많이 존재하여서 mechanical support, determining cell shape, movement of cell surface을 돕는다.
-> migration of cell, engulfing particles, cell division 하는데 도움을 준다.
  
mammals에 actin을 합성하는 gene은 6개 존재한다. 
4개는 서로 다른 부분의 근육에서 발현되고 나머지 2개는 근육이 아닌 곳에서 발현된다.

G-actin trimer가 T-actin으로 되는 과정에서는 수많은 protein이 관여한다. Barbed end = + end, Pointed end = - end

 assembly of actin filament (steps)

1. nucleation
actin monomer(G-actin)이 head-to-tail interaction을 통해서 다른 2개의 actin monomer와 중합한다.

2. actin polymerization
ATP을 필요로 하지 않는 과정인 F-actin polymerization은 reversible reaction이며 언제든지 필요에 의해서 부서질 수도 있다.

3. The rate(속도) at which monomers are added to filaments is proportional to their free subunits concentration. 
     
이때 합성은 166 ° 로 연결된 double-stranded helix을 가진다. 그리고 actin monomers가 동일한 방향으로 합성되기 때문에 actin filaments는 polarity을 가진다.
-> This polarity establishes the direction of myosin movement relative to actin.
     
비록 ATP을 필요로 하지 않는 과정이지만 F-actin polymerization은 ATP을 가지고 있는 actin monomers에서 더 쉽게 일어난다.
-> ATP-actin monomers are added to the + ends of filaments, and the ATP is then hydrolyzed to ADP after polymerization. 
--> barbed end에서 ATP-actin이 ADP-actin보다 5~10배 더 쉽게 filament에 중합된다.
pointed end에서 ADP-actin이 ATP-actin보다 덜 filament에 부착된 상태를 유지하려고 해서 더 쉽게 떨어져 나간다.

x-axis는 free monomers concentration을 의미한다.

critical concentration : F-actin에서 순(net) 분해와 신장이 없는 평형상태의 +/- 말단일 때의 free monomer concentration.
  
critical concentration of actin monomers는 + 말단이 – 말단보다 더 낮다.
-> 이는 free monomers의 농도가 낮을 때는 F-actin의 분해가 우세하고 free monomers의 농도가 높아지면 F-actin의 신장이 우세해짐을 의미한다. 
--> 이는 free monomers의 nucleation이 critical point을 넘어서 응결핵을 형성할 수 없다면 쉽게 분해되지만
critical point을 넘어서게 되는 environment에 놓이게 된다면 쉽게 분해되지 않고 순(net) 신장이 커지게 됨을 의미한다.

그렇다면 free monomer의 농도가 위의 농도의 중간(intermediate)인 경우에는 어떨까?
  
->이 경우를 treadmilling이라고 한다.

<<다음은 treadmiling에 대한 자세한 설명이다.>>

treadmilling (which takes place at intermediate concentrations of free monomers.)
free monomers의 농도가 중간이라는 것은 F-actin의 분해와 신장의 속도가 같아지는 평형상태를 의미한다.
 
-> ATP-actin이 barbed end에 붙고 ADP-actin이 pointed end에서 떨어져 나간다.
--> actin filament의 길이가 유지되고 actin monomers은 +->- 일정한 속도로 이동한다. 
 

<<위의 과정에서 inorganic phosphate는 왜 떨어져 나오는가?>>
완벽하게 actin filaments에 대한 이해가 되지 않았다면 이 질문에 답을 하기 쉽지 않다.

기본적으로 barbed ends가 pointed ends보다 critical concentration이 더 낮다.
이는 batbed ends에서 free G-actin monomers의 농도가 훨씬 낮다는 것을 의미한다.
-> 즉, net +/-가 일어나지 않는 상황에서의 free G-actin monomer의 농도가 낮다는 것은 
barbed ends에서 pointed ends보다 훨씬 더 빠른 속도로 elongation이 일어난다고 말할 수 있다.

elongation을 거치고 난 후의 steady-state 상태의 F-actin을 생각해보자.
filament의 ends는 critical concentration의 상태, subunit association = subunit dissociation이다.

그러나,
Hit & Run manner에 의해서 ATP-actin은 원래의 구조였던 ADP-actin으로 되돌아 가려고 한다.

->결국 ATP->ADP (hydrolysis of ATP)가 유도되고 inorganic  phosphate을 방출하게 된다.

-> steady-state에서의 relasing of inorganic phosphate는 barbed ends에 fresh ATP-actin을 붙이는 것이 pointed ends에 ADP-actin의 해리에 의해서 균형이 잡히는 과정을 유발한다.

--> 그래서 hydrolysis of ATP도 rate limiting factor이라고 할 수 있다.

cf) rate limiting factor(rate determining step), 이는 말 그대로 '전체 속도를 제한하는 가장 느린 속도의 인자'를 의미한다.  
trimer에 의한 nucleation도 rate limiting factor이고 steady-state에서의 ATP hydrolysis도 rate limiting factor이다.

<organization of actin filaments>

All of the actin-binding proteins involved in cross-linking contain at least two domains that bind actin filaments. filament to filament interaction은 cross-linking proteins(actin bundles, actin network)의 size, shape에 의해서 정해진다.

 
<actin bundles>
small rigid, tight protein
parallel bundle 
fimbrin protein은 장의 microvilli에서 처음 발견되었으며 다양한 세포들의 표면의 돌출부에서도 발견되었다. 
all fimbrin have the same polarity, with their (+) ends adjacent to the plasma membrane and bind to actin filaments as a monomer, holding two parallel filaments close together. 68kDa68 kDa,two adjacent actin-binding domains(ABD)을 가지고 있다. 
cross-link actin filaments into closely packed parallel bundles in which the filaments are 14nm apart.
  
<actin networks>
large flexible protein
orthogonal contractile bundle
α-actinin protein binds to actin as a dimer, each subunit of which is a 102kDa102 kDa, containing a single actin-binding domains(ABD) cross-link filaments into more loosely spaced contractile bundles in which the filaments are separated by 40nm.
α-helical spacer domain을 가지고 있으며 flexible structure의 특성을 지닌다.
->  filaments 사이의 증가된 공간은 myosin으로 하여금 actin filaments와 interaction  
--> bundles to contract

 

filamin protein
  
filamin binds actin as a dimer of two 280 kDa subunits
actin binding domain과 domerization domain이 각각의 subunit의 반대편에 존재한다.
-> filamin dimer is a flexible V-shaped molecule and forms cross-links between orthogonal actin filaments
--> loose 3D meshwork
  
  
<association of actin filaments with the plasma membrane>
erythrocyte(red blood cell)은 nucleus, internal organelles, microtubles, intermediate microfilaments가 없다.
-> plasma membrane과 cortical actin cytoskeleton에 대한 연구가 잘 진행될 수 있다. 
-> cell cortex(actin filaments + actin-binding proteins) determines cell shape and is involved in a variety of cell surface activities, including movement.

erythrocyte의 cortical skeleton은 spectrin에 의해서 정해진다.
spectrin은 calponin family에 속하는 protein이다. 
  
calponin family : spectrin, fimbrin, α-actinin, filamin, dystrophin
calponin family는 actin-binding proteins이다.이다.
  
All spectrins are tetramers consisting two distinct polypeptide chains called α β chains associate to form tetramers with two actin-binding domains(ABD) separated by 200nm.
  
Although spectrin itself binds phospholipids in the plasma membrane, the major link between the spectrin-actin network and the plasma membrane is provided by ankyrin which bind both to spectrin and to the cytoplasmic domain of band3.
  
protein4.1은 spectrin-actin junction에 붙을 뿐만 아니라 cytoplasmic domain of glycophorin에도 붙는다.
  
spectrin, ankyrin, protein4.1과 관련된 protein들은 다양한 범위에서의 cell에서 발현되어서 erythrocyte에서의 유사한 기능을 수행한다.
예를 들어, dystrophin은 Duchenne, Becker disease와 관련된 근육병 관련 유전자의 산물이며, 427 kDa, actin-binding protein이다. 

spectrin과 동일하게 dystrophin은 actin filaments와 muscle cell plasma membrane의 transmembrane protein을 연결한다.
이러한 transmembrane protein은 cytoskeleton과 ECM을 연결한다.
-> dystophin은 근육 수축 과정에서 cell stability에 중요한 역할을 한다.
  
Duchenne, Becker disease와 같은 성 연관 질환은 골격근을 쇠퇴시키는 결과를 가져오고 10대 혹은 20대 초반에 죽게 만든다. Duchenne, Becker disease을 가지고 있는 환자들은 dystropy가 없거나 비정상상태로 존재하였다. 
 

표면이 동일한 erythrocyte와 다르게 대부분의 cells은 adjacent cells, ECM와의 contact을 하기 위해서 plasma membrane의 specialized regions을 가지고 있는데 이곳에서 bundles of actin filaments가 cell contact가 일어나는 장소의 cytoskeleton을 고정시킨다.
특히, tissue culture에서의 fibroblast fibroblast는 배양접시 표면으로ECM proteins을 분비하여서 EDC과 integrins을 통해서 붙는다.
-> focal adhesion이 이렇게 형성되고 large bundles of actin filaments(stress fibers)가 붙는 장소가 된다.
     

stress fibers are contractile bundles of actin filaments cross-linked by  α-actinin, tropomyosin which anchor the cell and exert tension against the substream.
-> They are attatched to the plasma membrane at focal adhesions via interaction with talin, vinculin, integrin 

talin,  α-actinin bind to the cytoplasmic domains of integrins.
talin binds to vinculin and both bind actin.
  
In sheet of epithelial cells, adherens juction, a continuous belt-like structure(circumferential belt), forms an adhesion belt around each cell.
  
epithelial cells
  
cadherins (transmembrane proteins) bind to cytoplasmic catenins anchoring actin filaments. The cadherins form a complex with catenins which interact with vinculin and other actin-binding proteins
  
대부분 세포의 돌출, 확장은 cell movement, phagocytosis, absorption of nutrients와 연관되어있고 대부분 actin filaments와 연관되어있다.
왜냐 하면 actin filaments가 relatively permanent 혹은 rapidly rearranging 한 성질을 가지기 때문이다.
  
actin-based cell surface protrusions are microvilli, fingerlike extensions of the plasma membrane that are particularly surfaces of cells involved in absorption(e.g epithelial cells lining the intestine,
  
epithelial cells lining the intestine form a layer on the apical surface(선단 표면)에선단표면) 세포마다 1000개의 미세 융모를 가지고 있으며 10~20배의 표면적을 넓힌다.
auditory hair cell(청각 유모세포)에는청각유모세포)stereocilia라는 microvilli 형태의 cell protrusion이 존재하여 소리를 감지하는 역할을 한다.
  
microvilli에는 20~30개의 actin filaments가 closely packed parallel bundle로 구성되어있다. fimbrin, villin에 의해서 cross-linked 된다.
  
villin은 95kDa95 kDa의epithelial cell에 특화된 protein으로서 intestine, kidney tubules cell junctions에 존재한다.
  
calmodulin, myosinⅠ은 lateral arms을 구성하며 microvilli의 cell membrane의 운동에 관여한다. 그들의 지지대에는 terminal web이라고 불리는 spectrin을 많이 가지고 있는 actin cortex가 있다.
  
<cell surface protrusions and cell movement>
  
in respond to extracellular stimuli is regulated by small GTP-binding proteins of the Rho protein family(Cdc42, Rho, Rac).
signals activates Rho protein family members, which function to promote actin polymerization.
  
Rho protein activates -> 1. WASP stimulate Arp2/3 complex
-> 2. formins
3, Cofilin cleaving existing filaments and providing new barbed ends to support filament branching and growth. 
4. profilin generate high local concentrations of ATP-actin -> (+) ends의 actin filaments의 성장이 효과적으로 선호되고 상당한 힘을 만들어낸다. 
  
새로운 actin-filaments가 만들어지면서 lipids, proteins을 전달하는 길을 만들게 된다.
-> cell attachment to a surface는 cell-substratum 부착에서의 rebuilding을 필요로 한다.
   
  
slow moving cells, such as epithelial cells or fibroblasts attachment involves the formation of focal adhesion.
  
fast moving cells, such as amoebas or white blood cells form diffuse attachment with substratum.
  
final stage of cell migration (retraction of the trailing edge)
Arf and Rho protein families은 기존의 focal adhesions을 부수고 trailing edge에 있는 plasma membrane의 endocytosis을 조절한다.
-> new focal adhesions at the leading edge then pull the trailing edge of the cell forward.